Kitanda cha PCR cha moja kwa moja cha Damu

Ukuzaji wa haraka wa jeni lengwa moja kwa moja ukitumia damu kama kiolezo bila uchimbaji.

Kiti hiki kinachukua kinasaba ya anti-inhibitor DNA polymerase ya maumbile ili kukuza vyema jeni-nakala moja katika jenomu ya mwanadamu. Mfumo wa bafa ulioboreshwa vizuri kwenye kitanda hiki husaidia polymerase kupinga vizuizi vya vizuizi vya PCR, kwa hivyo inaweza kukuza moja kwa moja DNA ikitumia seli za damu na zilizotengenezwa kama templeti. Bidhaa hii ni rahisi kufanya kazi na haiitaji hatua ngumu kama utakaso wa DNA au matibabu ya sampuli.
Kiti hiki hutolewa kama 2 × MasterMix, na athari inaweza kufanywa kwa kuongeza tu templeti ya damu na vianzio vya ugunduzi vinavyolingana. Inaweza kutumika kwenye seli zilizotengenezwa za mamalia kama wanadamu, panya, nguruwe, ng'ombe na spishi zingine, na damu safi au 4 ℃ iliyohifadhiwa, anticoagulant (EDTA, citrate, heparin), vifungo vya damu vilivyochomwa na matangazo ya damu kavu. zilizohifadhiwa kwenye kadi za kibiashara za Whatman 903 na FTA Elute.

Paka. Hapana	Ukubwa wa Ufungashaji
4992529	20 ×l × 100 rxn
4992530	20 ×l × 500 rxn

Tuma barua pepe kwetu

Maelezo ya Bidhaa

Mfano wa Majaribio

Maswali Yanayoulizwa Sana

Vitambulisho vya Bidhaa

Vipengele

■ Rahisi na ya haraka: Ukuzaji wa PCR unaweza kufanywa moja kwa moja ukitumia damu kama kiolezo, bila hitaji la hatua za kuchosha za utayarishaji wa sampuli na uchimbaji wa DNA.
■ Usafi wa hali ya juu: Kuruka kwa sampuli kabla ya matibabu na hatua za uchimbaji wa DNA zinaweza kusaidia kuzuia uchafuzi wa sampuli.
■ Kuingiza kwa kiwango cha juu: Kitambulisho cha PCR kwa sampuli kubwa kinaweza kufanywa kwa kuchanganya kit na 96/384-vizuri PCR sahani.
■ Ulimwengu wenye nguvu: Kiti hiki kinaweza kukuza vizuri vipande vya juu vya GC au vipande vilivyo na muundo tata wa sekondari, na urefu wa kukuza unaweza kuwa hadi 5 kb.
■ Upinzani mkali wa mkazo: Kiti hiki kinaweza kutumika kwa spishi anuwai na sampuli za damu zilizohifadhiwa kwa njia tofauti.

Maombi

Bidhaa za PCR za kit hii zina "A" katika mwisho wa 3', ambayo inaweza kutumika moja kwa moja kwa uundaji wa vector wa TA. Zana hii inaweza kutumika kwa kukuza kipande cha chembe za DNA, uchambuzi wa juu wa maumbile na uchanganuzi wa genotyping (kama vile ugunduzi wa jeni).

Bidhaa zote zinaweza kuboreshwa kwa ODM / OEM. Kwa maelezo,tafadhali bofya Huduma iliyoboreshwa (ODM / OEM)

Iliyotangulia: TIANcombi DNA Lyse & Det PCR Kit

Ifuatayo: Kitambaa cha kipanya cha PCR Kit

	Kutumia anticoagulation ya EDTA ya binadamu kama kiolezo, jeni 4 zilizo na vitu tofauti vya GC ziliongezwa na Kitengo cha Damu cha moja kwa moja cha Damu. Mfumo wa mmenyuko wa PCR ulikuwa 20 μl, na damu 1 μl ilitumika kama templeti. M: TIANGEN Alama ya II; 1: Ukubwa wa vipande 1090 bp, GC yaliyomo 68.1%; 2: Ukubwa wa kipande 1915 bp, GC yaliyomo 70.4%; 3: Ukubwa wa kipande 448 bp, GC yaliyomo 74.8%; 4: Ukubwa wa vipande 1527 bp, GC yaliyomo 61.5%. Matokeo ya majaribio: Damu ya PCR ya moja kwa moja ya Damu inaweza kukuza vyema vipande vya DNA na yaliyomo kwenye GC katika kiwango cha 61.5% -74.8%, ikidokeza kuwa inauwezo wa kukuza vipande vya juu-GC.
	Kutumia anticoagulation ya kibinadamu ya EDTA kama kiolezo, jeni 5 zilizo na urefu tofauti (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 na Hn4.0) ziliongezwa na Kitengo cha Damu cha PCR. Mfumo wa mmenyuko wa PCR ulikuwa 20 μl, na damu 1 μl ilitumika kama templeti. M: TIANGEN Alama ya II; 1-3: 3 sampuli tofauti za damu; NTC: udhibiti bila vichungi. Matokeo ya majaribio: Damu ya PCR ya moja kwa moja ya Damu inaweza kukuza vipande na urefu mrefu kama 4 kb, ikidokeza kuwa ina uwezo wa kukuza vipande virefu.
	Kutumia anticoagulation ya EDTA ya binadamu kama templeti, Kitengo cha Damu ya moja kwa moja ya Damu ilitumika kwa kugundua PCR za sampuli tofauti za damu. Mfumo wa mmenyuko wa PCR ulikuwa 20 μl, na damu 1 μl ilitumika kama templeti. M: TIANGEN Alama ya II; 1-9: kiwango cha upakiaji wa damu ni 0.1 μl, 0.2 μl, 0.3 μl, 0.4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl na 5 μl, mtawaliwa; NTC: udhibiti bila templeti Matokeo ya majaribio: Damu ya PCR ya moja kwa moja ya damu ina upinzani mkali kwa damu na inaweza kukuza sampuli za damu na upakiaji wa 0.1-5 μl.
	Sampuli za damu kutoka kwa binadamu, panya, kuku na spishi zingine zilizo na matibabu tofauti zilitumika kama templeti. Dawa ya PCR ya moja kwa moja ilitumika kukuza PRNP (binadamu, 750 bp), Actin (panya, 200 bp), na β-Actin (Kuku, 1.0 kb). Mfumo wa mmenyuko wa PCR ulikuwa 20 μl, na damu 1 μl ilitumika kama templeti. M: TIANGEN Alama ya II. Matokeo ya majaribio: Damu ya PCR ya moja kwa moja ya damu inaweza kutumika kwenye sampuli anuwai, na ugunduzi wa moja kwa moja wa PCR unaweza kufanywa kwenye sampuli za damu kutoka spishi anuwai zilizo na matibabu tofauti.

Swali: Hakuna bendi za kukuza

Kiolezo cha A-1

■ Kiolezo kina uchafu wa protini au vizuizi vya Taq, n.k. —Safisha templeti ya DNA, ondoa uchafu wa protini au dondoo la templeti na vifaa vya utakaso.

■ Uwekaji wa templeti haujakamilika - - Ongeza sawasawa joto la kujitolea na kuongeza muda wa kutengana.

■ Uharibifu wa kiolezo ——Tayarisha kiolezo.

Utangulizi wa A-2

Quality Ubora duni wa vichangamsha — -Tengeneza upya kitangulizi.

■ Uharibifu wa vianzio - —Pokea viwango vya juu vya mkusanyiko kuwa kiasi kidogo cha kuhifadhi. Epuka kufungia na kuyeyusha au muda mrefu wa 4 ° C iliyohifadhiwa.

■ Ubunifu usiofaa wa vichungi (k.v.

Mg-3 Mg²⁺mkusanyiko

■ Mg²⁺ mkusanyiko ni mdogo sana -— Ongeza Vizuri Mg²⁺mkusanyiko: Boresha Mg²⁺ mkusanyiko na safu ya athari kutoka 1 mM hadi 3 mM na muda wa 0.5 mM kuamua Mg mojawapo²⁺ mkusanyiko kwa kila template na primer.

Joto la A-4 la kujifunga

■ Joto la juu la kuambatisha huathiri kumfunga primer na templeti. - Punguza joto linalounganisha na kuongeza hali hiyo kwa gradient ya 2 ° C.

Wakati wa ugani wa -5

■ Muda mfupi wa ugani - - Ongeza muda wa ugani.

Swali: Chanya ya uwongo

Phenomena: Sampuli hasi pia zinaonyesha bendi za mlolongo wa lengo.

Uchafuzi wa A-1 wa PCR

■ Uchafuzi wa msalaba wa mlolongo wa shabaha au bidhaa za kukuza —— Kwa uangalifu usiweke bomba sampuli iliyo na mlolongo wa shabaha kwenye sampuli hasi au umwagike nje ya bomba la centrifuge. Vitendanishi au vifaa vinapaswa kuchomwa moto ili kuondoa asidi za kiini zilizopo, na uwepo wa uchafuzi unapaswa kuamua kupitia majaribio mabaya ya kudhibiti.

■ Ukolezi wa vitendanishi - —Pokea vitendanishi na uvihifadhi kwa joto la chini.

A-2 Mkuur

■ Mg²⁺ mkusanyiko ni mdogo sana -— Ongeza Vizuri Mg²⁺ mkusanyiko: Boresha Mg²⁺ mkusanyiko na safu ya athari kutoka 1 mM hadi 3 mM na muda wa 0.5 mM kuamua Mg mojawapo²⁺ mkusanyiko kwa kila template na primer.

■ Ubunifu wa vianzio visivyo sahihi, na mlolongo wa malengo una homolojia na mlolongo usiolenga. —- Tengeneza upya viboreshaji.

Swali: Ukuzaji usio maalum

Phenomena: Bendi za kukuza PCR haziendani na saizi inayotarajiwa, iwe kubwa au ndogo, au wakati mwingine bendi zote za kukuza na bendi zisizo maalum za kukuza hufanyika.

Utangulizi wa A-1

■ Upendeleo duni wa mwanzo

- - Kubuni upya primer.

■ Mkusanyiko wa kiwango cha juu ni cha juu sana - - Ongeza vizuri joto la kutengana na kuongeza muda wa kutengana.

Mg-A-2 Mg²⁺ mkusanyiko

■ Mg²⁺ mkusanyiko ni mkubwa sana — -Punguza vizuri mkusanyiko wa Mg2 +: Boresha Mg²⁺ mkusanyiko na safu ya athari kutoka 1 mM hadi 3 mM na muda wa 0.5 mM kuamua Mg mojawapo²⁺ mkusanyiko kwa kila template na primer.

A-3 polymerase inayoweza kutibika

■ Kiasi cha enzyme nyingi - - Punguza kiwango cha enzyme ipasavyo kwa vipindi vya 0.5 U.

Joto la A-4 la kujifunga

■ Joto la kufunika ni la chini sana — - Ongeza vizuri joto la kuambatanisha au tumia njia mbili za kuziba

Mizunguko ya PC-A-5

■ Mizunguko mingi sana ya PCR ——Punguza idadi ya mizunguko ya PCR.

Swali: Patchy au smear bendi

Utangulizi wa A-1——Upekee wa umaskini ——Buni upya kitangulizi, badilisha msimamo na urefu wa kitangulizi ili kuongeza umaalum wake; au fanya PCR iliyohifadhiwa.

Kiini-2 cha DNA

——Template sio safi - -Takasa kiolezo au toa DNA na vifaa vya utakaso.

Mg-3 Mg²⁺ mkusanyiko

——Ma²⁺ mkusanyiko ni mkubwa sana -—Punguza ipasavyo Mg²⁺ mkusanyiko: Boresha Mg²⁺ mkusanyiko na safu ya athari kutoka 1 mM hadi 3 mM na muda wa 0.5 mM kuamua Mg mojawapo²⁺ mkusanyiko kwa kila template na primer.

A-4 dNTP

—— Mkusanyiko wa dNTP ni kubwa mno —— Punguza mkusanyiko wa dNTP ipasavyo

Joto la kujumlisha A-5

—— Joto la chini kabisa la kuambatisha —— Ongeza vizuri joto linalounganisha

Mzunguko wa A-6

——Mizunguko mingi sana —— Ongeza idadi ya mzunguko

Swali: Kiasi kipi cha DNA kinapaswa kuongezwa katika mfumo wa mmenyuko wa PCR 50 μl?

Swali: Jinsi ya kukuza vipande virefu?

Hatua ya kwanza ni kuchagua polymerase inayofaa. Taq polymerase ya kawaida haiwezi kusahihisha kwa sababu ya ukosefu wa shughuli ya msamaha ya 3'-5, na kutofanana kutapunguza sana ufanisi wa ugani wa vipande. Kwa hivyo, polymerase ya kawaida ya Taq haiwezi kukuza vyema vipande vya lengo kubwa kuliko 5 kb. Taq polymerase iliyo na muundo maalum au uaminifu mwingine wa hali ya juu inapaswa kuchaguliwa ili kuboresha ufanisi wa ugani na kukidhi mahitaji ya kukuza kipande kirefu. Kwa kuongezea, ukuzaji wa vipande virefu pia inahitaji marekebisho yanayolingana ya muundo wa mwanzo, muda wa kujitolea, muda wa ugani, pH ya bafa, nk Kawaida, viboreshaji vyenye 18-24 bp vinaweza kusababisha mavuno bora. Ili kuzuia uharibifu wa templeti, wakati wa kujitolea kwa 94 ° C unapaswa kupunguzwa hadi sekunde 30 au chini kwa kila mzunguko, na wakati wa kuongezeka kwa joto hadi 94 ° C kabla ya kukuza inapaswa kuwa chini ya dakika 1. Kwa kuongezea, kuweka joto la ugani kwa karibu 68 ° C na kubuni muda wa ugani kulingana na kiwango cha 1 kb / min kunaweza kuhakikisha ukuzaji mzuri wa vipande virefu.

Swali: Jinsi ya kuboresha uaminifu wa kukuza PCR?

Kiwango cha makosa ya kukuza PCR inaweza kupunguzwa kwa kutumia polima nyingi za DNA na uaminifu wa hali ya juu. Miongoni mwa polima zote za Taq DNA zilizopatikana hadi sasa, enzyme ya Pfu ina kiwango cha chini kabisa cha makosa na uaminifu wa hali ya juu (angalia jedwali lililoambatanishwa). Mbali na uteuzi wa enzyme, watafiti wanaweza kupunguza zaidi kiwango cha mabadiliko ya PCR kwa kuboresha hali ya athari, pamoja na kuongeza muundo wa bafa, mkusanyiko wa polymerase inayoweza kutibika na kuongeza idadi ya mzunguko wa PCR.

Andika ujumbe wako hapa na ututumie