Moduli ya Mchanganyiko ya TIANSeq RNA Frag / cDNA

Kwa sasa, teknolojia ya ufuatiliaji wa hali ya juu inategemea teknolojia ya upangaji kizazi kijacho. Kwa kuwa urefu wa kusoma wa teknolojia inayofuata ya ufuatiliaji wa kizazi kijacho ni mdogo, lazima tuvunje mpangilio kamili wa urefu katika maktaba ndogo ya vipande. Kulingana na mahitaji ya majaribio tofauti ya upangaji, kawaida tunachagua upangaji wa moja au upangaji wa mara mbili. Hivi sasa vipande vya DNA vya maktaba ya kizazi kijacho vinasambazwa kwa jumla ya 200-800 bp.

a) DNA ni duni na ina vizuia. Tumia sampuli za ubora wa DNA ili kuzuia uzuiaji wa shughuli za enzyme.

b) Kiasi cha sampuli ya DNA haitoshi wakati wa kutumia njia isiyo na PCR kujenga maktaba ya DNA. Wakati uingizaji wa DNA iliyogawanyika unazidi ng 50, mtiririko wa bure wa PCR unaweza kufanywa kwa hiari wakati wa mchakato wa ujenzi wa maktaba. Ikiwa nambari ya nakala ya maktaba ni ya chini sana kuweza kufuatiliwa moja kwa moja, maktaba ya DNA inaweza kukuzwa na PCR baada ya kuunganishwa kwa adapta.

c) Ukolezi wa RNA unasababisha uchafuzi wa awali wa DNA ya uchafuzi wa RNA inaweza kuwepo katika mchakato wa utakaso wa DNA ya genomic, ambayo inaweza kusababisha upimaji wa DNA isiyo sahihi na upakiaji wa DNA wa kutosha wakati wa ujenzi wa maktaba. RNA inaweza kuondolewa kwa kutibu na RNase.

A-1

a) Vipande vidogo (60 bp-120 bp) vinaonekana vipande vidogo kawaida ni vipande vya adapta au vijidudu vilivyoundwa na adapta. Utakaso na shanga za Agencourt AMPure XP zinaweza kuondoa vipande hivi vya adapta na kuhakikisha ubora wa upangaji.

b) Vipande vikubwa vinaonekana kwenye maktaba baada ya kukuza PCR Ukubwa wa kipande cha maktaba ya DNA itaongezeka kwa 120 bp baada ya adapta kushonwa. Ikiwa kipande cha DNA kimeongezeka kwa zaidi ya 120 bp baada ya kuunganishwa kwa adapta, inaweza kusababishwa na ukuzaji wa vipande visivyo vya kawaida vya kuongeza nguvu kwa PCR. Kupunguza idadi ya mizunguko ya PCR kunaweza kuzuia hali hiyo.

c) Ukubwa usio wa kawaida wa vipande vya DNA vya maktaba baada ya kuunganishwa kwa adapta Urefu wa adapta katika kit hiki ni 60 bp. Wakati ncha mbili za kipande zimeunganishwa kwa adapta, urefu utaongezeka tu kwa 120 bp. Unapotumia adapta tofauti na ile iliyotolewa na vifaa hivi, tafadhali wasiliana na muuzaji kutoa habari muhimu kama vile urefu wa adapta. Tafadhali hakikisha kuwa mtiririko wa jaribio na operesheni zinafuata hatua zilizoelezewa katika mwongozo.

d) Ukubwa usio wa kawaida wa kipande cha DNA kabla ya kuunganishwa kwa adapta Sababu ya shida hii inaweza kusababishwa na hali mbaya ya athari wakati wa kugawanyika kwa DNA. Nyakati tofauti za majibu inapaswa kutumika kwa uingizaji tofauti wa DNA. Ikiwa uingizaji wa DNA ni zaidi ya ng 10, tunapendekeza kuchagua wakati wa majibu ya dakika 12 kama wakati wa kuanza kwa utaftaji, na saizi ya kipande iliyozalishwa kwa wakati huu iko katika kiwango cha 300-500 bp. Watumiaji wanaweza kuongeza au kupunguza urefu wa vipande vya DNA kwa dakika 2-4 kulingana na mahitaji yao wenyewe ili kuboresha vipande vya DNA na saizi inayohitajika.

A-2

a) Wakati wa kugawanyika haujaboreshwa Ikiwa DNA iliyogawanyika ni ndogo sana au kubwa sana, tafadhali rejelea Miongozo ya Uteuzi wa Wakati wa Kugawanyika iliyotolewa katika maagizo kuamua wakati wa majibu, na utumie wakati huu kama udhibiti, kwa kuongeza usanidi mfumo wa athari ili kuongeza au kufupisha dakika 3 ili kufanya marekebisho sahihi zaidi wakati wa kugawanyika.

A-3

Usambazaji usio wa kawaida wa DNA baada ya matibabu ya kugawanyika

a) Njia isiyo sahihi ya kutenganisha reagent, au reagent haijachanganywa kabisa baada ya kuyeyuka. Punguza mchanganyiko wa 5 × Mgawanyiko wa Enzyme kwenye barafu. Mara baada ya kunyolewa, changanya reagent sawasawa kwa kuzunguka chini ya bomba kwa upole. Usifanye vortex reagent!

b) Sampuli ya kuingiza DNA ina EDTA au vichafuzi vingine Kupungua kwa ioni za chumvi na mawakala wa kudanganya katika hatua ya utakaso wa DNA ni muhimu sana kwa kufanikiwa kwa jaribio. Ikiwa DNA imeyeyushwa katika 1 × TE, tumia njia iliyotolewa katika maagizo kufanya kugawanyika. Ikiwa mkusanyiko wa EDTA katika suluhisho hauna uhakika, inashauriwa kusafisha DNA na kuifuta kwa maji yaliyotengwa kwa athari inayofuata.

c) Usahihi wa awali wa kipimo cha DNA Ukubwa wa DNA iliyogawanyika inahusiana sana na kiwango cha uingizaji wa DNA. Kabla ya matibabu ya kugawanyika, hesabu sahihi ya DNA inayotumia Qubit, Picogreen na njia zingine ni muhimu kuamua kiwango halisi cha DNA katika mfumo wa athari.

 d) Utayarishaji wa mfumo wa athari haufuati maagizo Utayarishaji wa mfumo wa mmenyuko uliogawanyika lazima ufanyike kwenye barafu kabisa kulingana na maagizo. Ili kuhakikisha athari bora, vifaa vyote vya athari vinapaswa kuwekwa kwenye barafu na utayarishaji wa mfumo wa athari unapaswa kufanywa baada ya baridi kamili. Baada ya maandalizi kukamilika, tafadhali bonyeza au bomba ili uchanganye vizuri. Usifanye vortex!

1. Njia isiyofaa ya kuchanganya (vortex, oscillation vurugu, nk) itasababisha usambazaji usiokuwa wa kawaida wa vipande vya maktaba (kama inavyoonyeshwa kwenye takwimu ifuatayo), na hivyo kuathiri ubora wa maktaba. Kwa hivyo, wakati wa kuandaa suluhisho la majibu ya Mgawanyiko, tafadhali piga bomba chini na chini ili uchanganye, au tumia kidole cha kidole kubonyeza na kuchanganya sawasawa. Kuwa mwangalifu usichanganye na vortex.

2. Usafi wa juu wa DNA lazima utumike kwa ujenzi wa maktaba

■ Uadilifu mzuri wa DNA: Bendi ya electrophoresis ni zaidi ya kb 30, bila mkia

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Kiasi cha kuingiza DNA lazima kiwe sahihi Inashauriwa kutumia njia za Qubit na PicoGreen kupima DNA, badala ya Nanodrop.

4. Yaliyomo ya EDTA katika suluhisho la DNA lazima iamuliwe EDTA ina ushawishi mkubwa kwa athari ya kugawanyika. Ikiwa yaliyomo kwenye EDTA ni ya juu, utakaso wa DNA unahitaji kufanywa kabla ya jaribio linalofuata.

5. Suluhisho la majibu ya kugawanyika lazima liandaliwe kwenye barafu Mchakato wa kugawanyika ni nyeti kwa joto la athari na wakati (haswa baada ya kuongeza kiimarishaji). Ili kuhakikisha usahihi wa wakati wa majibu, tafadhali andaa mfumo wa athari kwenye barafu.

6. Wakati wa kugawanyika lazima iwe sahihi Saa ya majibu ya hatua ya kugawanyika itaathiri moja kwa moja saizi ya bidhaa za vipande, na hivyo kuathiri usambazaji wa ukubwa wa vipande vya DNA kwenye maktaba.

1. Ni aina gani ya sampuli inayotumika kwa vifaa hivi?

Aina ya sampuli inayotumika ya kit hii inaweza kuwa jumla ya RNA au mRNA iliyosafishwa na uadilifu mzuri wa RNA. Ikiwa jumla ya RNA inatumiwa kujenga maktaba, inashauriwa kutumia vifaa vya kumaliza rRNA (Paka # 4992363/4992364/4992391) kuondoa rRNA kwanza.

2. Je! Sampuli za FFPE zinaweza kutumika kujenga maktaba na kit hiki?

MRNA katika sampuli za FFPE zitashushwa kwa kiwango fulani, na uadilifu duni. Unapotumia kit hiki kwa ujenzi wa maktaba, inashauriwa kuongeza wakati wa kugawanyika (fupisha wakati wa kugawanyika au kutofanya kugawanyika).

3. Kutumia hatua ya uteuzi wa ukubwa iliyotolewa katika mwongozo wa bidhaa, ni nini kinachoweza kusababisha sehemu iliyoingizwa kuonekana kupotoka kidogo?

Uteuzi wa saizi utafanywa kwa kufuata kali na hatua ya uteuzi wa saizi katika mwongozo huu wa bidhaa. Ikiwa kuna kupotoka, sababu inaweza kuwa kwamba shanga za sumaku hazina usawa kwa joto la kawaida au hazijachanganywa kabisa, bomba sio sahihi au kioevu kinabaki kwenye ncha. Inashauriwa kutumia vidokezo na adsorption ya chini kwa jaribio.

4. Uchaguzi wa adapta katika ujenzi wa maktaba

Zana ya ujenzi wa maktaba haina reagent ya adapta, na inashauriwa kutumia kit hiki pamoja na Adapter ya TIANSeq Single-Index (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC ya maktaba

Utambuzi wa idadi ya maktaba: Qubit na qPCR hutumiwa kuamua mkusanyiko wa umati na mkusanyiko wa molar wa maktaba mtawaliwa. Uendeshaji ni madhubuti kulingana na mwongozo wa bidhaa. Mkusanyiko wa maktaba kwa ujumla utatimiza mahitaji ya mpangilio wa NGS. Kugundua masafa ya usambazaji wa maktaba: Kutumia Bioanalyzer ya Agilent 2100 kugundua safu ya usambazaji wa maktaba.

6. Uteuzi wa nambari ya mzunguko wa kukuza

Kulingana na maagizo, idadi ya mizunguko ya PCR ni 6-12, na idadi ya mizunguko ya PCR inahitajika inapaswa kuchaguliwa kulingana na uingizaji wa sampuli. Katika maktaba ya mavuno mengi, juu ya ukuzaji kawaida hufanyika kwa viwango tofauti, ambavyo hudhihirishwa na kilele kikubwa kidogo baada ya kilele cha anuwai katika kugundua Agilent 2100 Bioanalyzer, au mkusanyiko wa Qubit uko chini kuliko ule wa qPCR. Upole juu ya ukuzaji ni jambo la kawaida, ambalo haliathiri mpangilio wa maktaba na uchambuzi wa data unaofuata.

7. Spikes inaonekana katika wasifu wa kugundua wa Agilent 2100 Bioanalyzer

Kuonekana kwa spikes katika ugunduzi wa Agilent 2100 Bioanalyzer ni kwa sababu ya kugawanyika kwa sampuli, ambapo kutakuwa na vipande zaidi katika saizi fulani, na hii itakuwa dhahiri zaidi baada ya utajiri wa PCR. Katika kesi hii, inashauriwa kutofanya uteuzi wa saizi, yaani kuweka hali ya kugawanyika kuwa 94 ° C kwa dakika 15 zilizochomwa, ambapo mgawanyo wa vipande ni mdogo na umejilimbikizia, na uhusiano wa ndani unaweza kuboreshwa.