2 × Pfu PCR Mchanganyiko

Kiolezo cha A-1

■ Kiolezo kina uchafu wa protini au vizuizi vya Taq, n.k. —Safisha templeti ya DNA, ondoa uchafu wa protini au dondoo la templeti na vifaa vya utakaso.

■ Uwekaji wa templeti haujakamilika - - Ongeza sawasawa joto la kujitolea na kuongeza muda wa kutengana.

■ Uharibifu wa kiolezo ——Tayarisha kiolezo.

Utangulizi wa A-2

Quality Ubora duni wa vichangamsha — -Tengeneza upya kitangulizi.

■ Uharibifu wa vianzio - —Pokea viwango vya juu vya mkusanyiko kuwa kiasi kidogo cha kuhifadhi. Epuka kufungia na kuyeyusha au muda mrefu wa 4 ° C iliyohifadhiwa.

■ Ubunifu usiofaa wa vichungi (k.v.

Mg-3 Mg²⁺mkusanyiko

■ Mg²⁺ mkusanyiko ni mdogo sana -— Ongeza Vizuri Mg²⁺ mkusanyiko: Boresha Mg²⁺ mkusanyiko na safu ya athari kutoka 1 mM hadi 3 mM na muda wa 0.5 mM kuamua Mg mojawapo²⁺ mkusanyiko kwa kila template na primer.

Joto la A-4 la kujifunga

■ Joto la juu la kuambatisha huathiri kumfunga primer na templeti. - Punguza joto linalounganisha na kuongeza hali hiyo kwa gradient ya 2 ° C.

Wakati wa ugani wa -5

■ Muda mfupi wa ugani - - Ongeza muda wa ugani.

Phenomena: Sampuli hasi pia zinaonyesha bendi za mlolongo wa lengo.

Uchafuzi wa A-1 wa PCR

■ Uchafuzi wa msalaba wa mlolongo wa shabaha au bidhaa za kukuza —— Kwa uangalifu usiweke bomba sampuli iliyo na mlolongo wa shabaha kwenye sampuli hasi au umwagike nje ya bomba la centrifuge. Vitendanishi au vifaa vinapaswa kuchomwa moto ili kuondoa asidi za kiini zilizopo, na uwepo wa uchafuzi unapaswa kuamua kupitia majaribio mabaya ya kudhibiti.

■ Ukolezi wa vitendanishi - —Pokea vitendanishi na uvihifadhi kwa joto la chini.

A-2 Mkuur

■ Mg²⁺ mkusanyiko ni mdogo sana -— Ongeza Vizuri Mg²⁺ mkusanyiko: Boresha Mg²⁺ mkusanyiko na safu ya athari kutoka 1 mM hadi 3 mM na muda wa 0.5 mM kuamua Mg mojawapo²⁺ mkusanyiko kwa kila template na primer.

■ Ubunifu wa vianzio visivyo sahihi, na mlolongo wa malengo una homolojia na mlolongo usiolenga. —- Tengeneza upya viboreshaji.

Phenomena: Bendi za kukuza PCR haziendani na saizi inayotarajiwa, iwe kubwa au ndogo, au wakati mwingine bendi zote za kukuza na bendi zisizo maalum za kukuza hufanyika.

Utangulizi wa A-1

■ Upendeleo duni wa mwanzo

- - Kubuni upya primer.

■ Mkusanyiko wa kiwango cha juu ni cha juu sana - - Ongeza vizuri joto la kutengana na kuongeza muda wa kutengana.

Mg-A-2 Mg²⁺ mkusanyiko

■ Mg²⁺ mkusanyiko ni mkubwa sana — -Punguza vizuri mkusanyiko wa Mg2 +: Boresha Mg²⁺ mkusanyiko na safu ya athari kutoka 1 mM hadi 3 mM na muda wa 0.5 mM kuamua Mg mojawapo²⁺ mkusanyiko kwa kila template na primer.

A-3 polymerase inayoweza kutibika

■ Kiasi cha enzyme nyingi - - Punguza kiwango cha enzyme ipasavyo kwa vipindi vya 0.5 U.

Joto la A-4 la kujifunga

■ Joto la kufunika ni la chini sana — - Ongeza vizuri joto la kuambatanisha au tumia njia mbili za kuziba

Mizunguko ya PC-A-5

■ Mizunguko mingi sana ya PCR ——Punguza idadi ya mizunguko ya PCR.

Utangulizi wa A-1——Upekee wa umaskini ——Buni upya kitangulizi, badilisha msimamo na urefu wa kitangulizi ili kuongeza umaalum wake; au fanya PCR iliyohifadhiwa.

Kiini-2 cha DNA

——Template sio safi - -Takasa kiolezo au toa DNA na vifaa vya utakaso.

Mg-3 Mg²⁺ mkusanyiko

——Ma²⁺ mkusanyiko ni mkubwa sana -—Punguza ipasavyo Mg²⁺ mkusanyiko: Boresha Mg²⁺ mkusanyiko na safu ya athari kutoka 1 mM hadi 3 mM na muda wa 0.5 mM kuamua Mg mojawapo²⁺ mkusanyiko kwa kila template na primer.

A-4 dNTP

—— Mkusanyiko wa dNTP ni kubwa mno —— Punguza mkusanyiko wa dNTP ipasavyo

Joto la kujumlisha A-5

—— Joto la chini kabisa la kuambatisha —— Ongeza vizuri joto linalounganisha

Mzunguko wa A-6

——Mizunguko mingi sana —— Ongeza idadi ya mzunguko

Hatua ya kwanza ni kuchagua polymerase inayofaa. Taq polymerase ya kawaida haiwezi kusahihisha kwa sababu ya ukosefu wa shughuli ya msamaha ya 3'-5, na kutofanana kutapunguza sana ufanisi wa ugani wa vipande. Kwa hivyo, polymerase ya kawaida ya Taq haiwezi kukuza vyema vipande vya lengo kubwa kuliko 5 kb. Taq polymerase iliyo na muundo maalum au uaminifu mwingine wa hali ya juu inapaswa kuchaguliwa ili kuboresha ufanisi wa ugani na kukidhi mahitaji ya kukuza kipande kirefu. Kwa kuongezea, ukuzaji wa vipande virefu pia inahitaji marekebisho yanayolingana ya muundo wa mwanzo, muda wa kujitolea, muda wa ugani, pH ya bafa, nk Kawaida, viboreshaji vyenye 18-24 bp vinaweza kusababisha mavuno bora. Ili kuzuia uharibifu wa templeti, wakati wa kujitolea kwa 94 ° C unapaswa kupunguzwa hadi sekunde 30 au chini kwa kila mzunguko, na wakati wa kuongezeka kwa joto hadi 94 ° C kabla ya kukuza inapaswa kuwa chini ya dakika 1. Kwa kuongezea, kuweka joto la ugani kwa karibu 68 ° C na kubuni muda wa ugani kulingana na kiwango cha 1 kb / min kunaweza kuhakikisha ukuzaji mzuri wa vipande virefu.

Kiwango cha makosa ya kukuza PCR inaweza kupunguzwa kwa kutumia polima nyingi za DNA na uaminifu wa hali ya juu. Miongoni mwa polima zote za Taq DNA zilizopatikana hadi sasa, enzyme ya Pfu ina kiwango cha chini kabisa cha makosa na uaminifu wa hali ya juu (angalia jedwali lililoambatanishwa). Mbali na uteuzi wa enzyme, watafiti wanaweza kupunguza zaidi kiwango cha mabadiliko ya PCR kwa kuboresha hali ya athari, pamoja na kuongeza muundo wa bafa, mkusanyiko wa polymerase inayoweza kutibika na kuongeza idadi ya mzunguko wa PCR.